Detektor Hamburan Cahaya Evaporatif (ELSD) adalah detektor massa baru dengan penerapan teoretis untuk senyawa apa pun yang dapat membentuk partikel gas. Edisi Farmakope 2025 menetapkan penggunaan Deteksi Hamburan Cahaya Evaporatif (ELSD) untuk analisis dan kontrol kualitas lebih dari 100 jenis obat. Dalam praktiknya, ELSD lebih sering diterapkan pada senyawa yang tidak memiliki penyerapan ultraviolet (UV), seperti astragalosida, karbohidrat, aminoglikosida, dan kolesterol, seringkali berfungsi sebagai metode deteksi pelengkap untuk detektor UV dan fluoresensi. Namun, hasil ELSD dipengaruhi oleh banyak faktor, termasuk komposisi fase gerak, konsentrasi pelarut organik, mode elusi, dan kondisi nebulisasi. Oleh karena itu, untuk memastikan hasil analitik yang akurat dan konsisten, sangat penting untuk mengevaluasi dampak faktor-faktor ini terhadap hasil.
Studi ini, mengacu pada metode analitik untuk hidroklorida spektinomisin dari Bagian II Farmakope 2025 dan dipandu oleh prinsip ICH QbD, menggunakan desain eksperimen ortogonal untuk menyaring dan mengoptimalkan kondisi analitik.
Gambar 1 Hidroklorida Spektinomisin
2. Instrumen dan Metode
Dalam studi ini, analisis kromatografi dilakukan menggunakan sistem HPLC seri LC3200 Wayeal. Konfigurasi instrumen mencakup pompa gradien kuaterner, autosampler, kompartemen kolom, dan Detektor Hamburan Cahaya Evaporatif. Kontrol sistem dan akuisisi/pemrosesan data dilakukan dengan perangkat lunak kromatografi SmartLab 2.0.
Tabel 1 Kondisi HPLC
| Kolom Kromatografi |
Nova Atom PC18 (4.6*250mm, 5μm) |
| Fase Gerak |
Larutan berair asam trifluoroasetat 0.1mol/L |
| Laju Aliran (mL/menit) |
0.6 |
| Suhu kolom |
35 |
| Volume Injeksi (μL) |
20 |
| Suhu Nebulizer ELSD （°C） |
85 |
| Suhu Evaporator ELSD （°C） |
80 |
| Suhu Deteksi ELSD (°C) |
50 |
| Laju Aliran Gas （SLM） |
0.2 |
3. Persiapan Larutan
Larutan Sampel:Larutan stok hidroklorida spektinomisin disediakan oleh klien dengan konsentrasi berlabel 10 mg/mL dan kemurnian 99.8%.
Larutan berair asam trifluoroasetat 0.1M：Pipetkan dengan tepat 6.8mL asam trifluoroasetat ke dalam labu volumetrik 1000mL. Encerkan hingga tanda dengan air murni dan campur rata. Terakhir, saring larutan vakum melalui filter membran selulosa 0.45μm sebelum digunakan.
Larutan Standar:Larutan stok diencerkan dengan air murni untuk menyiapkan larutan sampel dengan konsentrasi 0.15, 0.25, 0.35, 0.50, dan 0.70mg/mL, masing-masing. Setiap larutan kemudian disaring melalui filter membran selulosa 0.45μm sebelum digunakan.
4. Hasil dan Diskusi
Farmakope China menggunakan kondisi kromatografi yang identik untuk menganalisis zat terkait dan kandungan komponen utama di bawah entri hidroklorida spektinomisin. Metode tersebut menyatakan bahwa "detektor dapat dikonfigurasi berdasarkan keadaan sebenarnya." Selama studi, dengan mempertimbangkan karakteristik instrumental dari ELSD3260, persyaratan metode analitik, dan literatur yang relevan, desain eksperimen Plackett-Burman digunakan untuk menyaring beberapa parameter eksperimen (Tabel 2 dan 3). Selanjutnya, desain Box-Behnken (Tabel 4) digunakan untuk mengoptimalkan respons area puncak detektor ELSD.
Tabel 2 Desain Eksperimen Plackett-Burman
| No. |
Laju Aliran (mL/menit) |
Suhu Kolom (°C) |
Suhu Nebulizer （°C） |
Suhu Evaporator （°C） |
Suhu Deteksi (°C) |
Laju Aliran Gas （SLM） |
Kompensasi Pasca-kolom |
| 1 |
0.8 |
35 |
60 |
50 |
50 |
0.4 |
Tidak |
| 2 |
0.6 |
35 |
50 |
60 |
50 |
0.6 |
Tidak |
| 3 |
0.6 |
30 |
60 |
60 |
50 |
0.4 |
Ya |
| 4 |
0.8 |
30 |
60 |
60 |
40 |
0.6 |
Tidak |
| 5 |
0.6 |
35 |
60 |
50 |
40 |
0.6 |
Ya |
| 6 |
0.8 |
30 |
50 |
50 |
50 |
0.6 |
Ya |
| 7 |
0.8 |
35 |
50 |
60 |
40 |
0.4 |
Ya |
| 8 |
0.6 |
30 |
50 |
50 |
40 |
0.4 |
Tidak |
Tabel 3 Analisis ANOVA Hasil Eksperimen Plackett-Burman
| Sumber Variasi |
Koefisien |
Nilai-t |
Nilai-p |
Signifikansi |
| Laju aliran |
-6.687 |
-8.10 |
<0.01 |
2 |
| Suhu kolom |
0.191 |
0.22 |
0.824 |
6 |
| Suhu Nebulizer （°C） |
5.342 |
6.29 |
<0.01 |
3 |
| Suhu Evaporator （°C） |
4.135 |
4.87 |
<0.01 |
4 |
| Suhu Deteksi (°C) |
0.171 |
0.21 |
0.842 |
7 |
| Laju Aliran Gas （SLM） |
-10.381 |
-12.23 |
<0.01 |
1 |
| Kompensasi Pasca-kolom |
-2.559 |
-3.02 |
<0.01 |
5 |
Seperti yang dapat dilihat dari Tabel 3, laju aliran gas, laju aliran fase gerak, dan kompensasi pasca-kolom menunjukkan efek negatif. Secara khusus, mengurangi laju aliran gas dan laju aliran fase gerak, bersama dengan menonaktifkan kompensasi pasca-kolom, dapat meningkatkan respons puncak kromatografi. Namun, menurunkan laju aliran fase gerak dapat menyebabkan pelebaran puncak yang meningkat dan mengurangi sensitivitas deteksi. Oleh karena itu, laju aliran dipertahankan konsisten dengan metode standar. Sementara suhu kolom dan suhu deteksi menunjukkan efek positif, mereka tidak secara signifikan meningkatkan nilai respons. Akibatnya, studi selanjutnya akan fokus pada pengoptimalan laju aliran gas, suhu nebulizer, dan suhu evaporator.
Efek laju aliran gas, suhu nebulizer, dan suhu evaporator pada nilai respons diselidiki dengan menggunakan desain eksperimen Box-Behnken dalam kerangka metodologi respons permukaan. Desain eksperimen disajikan dalam Tabel 4.
Tabel 4 Desain Eksperimen Box-Behnken
| No. |
Laju Aliran Gas (SLM) |
Suhu Nebulizer （°C） |
Suhu Evaporator （°C） |
| 1 |
0.15 |
75 |
80 |
| 2 |
0.15 |
85 |
80 |
| 3 |
0.25 |
75 |
80 |
| 4 |
0.25 |
85 |
80 |
| 5 |
0.15 |
80 |
75 |
| 6 |
0.15 |
80 |
85 |
| 7 |
0.25 |
80 |
75 |
| 8 |
0.25 |
80 |
85 |
| 9 |
0.2 |
75 |
75 |
| 10 |
0.2 |
75 |
85 |
| 11 |
0.2 |
85 |
75 |
| 12 |
0.2 |
85 |
85 |
| 13 |
0.2 |
80 |
80 |
Kondisi deteksi untuk hidroklorida spektinomisin ditentukan dengan mensimulasikan variasi area puncak menggunakan metodologi respons permukaan (Gambar 2) dan mempertimbangkan rentang parameter instrumental: suhu nebulizer 85°C, suhu evaporator 80°C, suhu detektor 50°C, dan laju aliran gas 0.2 SLM.
A. Efek Laju Aliran Gas dan Suhu Evaporator pada Area Puncak
B. Efek Laju Aliran Gas dan Suhu Nebulizer pada Area Puncak
C. Efek Suhu Nebulizer dan Suhu Evaporator pada Area Puncak
Gambar 2 Variasi Area Puncak
Presisi Injeksi
Larutan stok hidroklorida spektinomisin diencerkan menjadi 0.35mg/mL, dan enam injeksi berturut-turut dilakukan di bawah kondisi kromatografi yang ditentukan dengan kromatogram yang direkam. Simpangan baku relatif (RSD%) dari waktu retensi dan area puncak untuk puncak kromatografi hidroklorida spektinomisin dihitung. Hasilnya ditunjukkan pada Tabel 5.
Tabel 5 Hasil Uji Presisi Injeksi
| No. |
Waktu Retensi (menit) |
Area Puncak (SU*s) |
| 1 |
7.625 |
259.124 |
| 2 |
7.615 |
245.223 |
| 3 |
7.618 |
270.250 |
| 4 |
7.608 |
237.267 |
| 5 |
7.627 |
254.977 |
| 6 |
7.613 |
255.548 |
| RSD (%) |
0.09 |
4.49 |
Spesifisitas
Menurut pedoman ICH Q2(R2) tentang validasi prosedur analitik dan Bab Umum Farmakope China 〈9101〉 Pedoman Validasi Metode Analitik, metode yang dioptimalkan divalidasi untuk spesifisitas, rentang linier, akurasi, dan keterulangan.
Air murni dan larutan sampel (0.35 mg/mL) dianalisis secara paralel dengan kromatogram yang direkam. Hasil (Gambar 3) menunjukkan tidak ada puncak kromatografi pada waktu retensi hidroklorida spektinomisin dalam kromatogram air murni, sedangkan puncak untuk hidroklorida spektinomisin dalam larutan sampel mencapai pemisahan garis dasar dari puncak yang berdekatan (R > 1.5).
Gambar 3 Hasil Analitik Sampel Hidroklorida Spektinomisin (0.35mg/mL)
Rentang Linier
Siapkan tiga sampel paralel larutan stok hidroklorida spektinomisin sesuai dengan metode persiapan larutan standar, analisis di bawah kondisi kromatografi, dan rekam kromatogram. Lakukan analisis regresi menggunakan area puncak kromatografi dan konsentrasi yang sesuai.
Gambar 4 Hasil Uji Linearitas (Log-Ditransformasi vs. Tidak Ditransformasi)
Menurut literatur, hubungan antara nilai respons ELSD dan konsentrasi adalah nonlinier, memerlukan transformasi logaritmik dari nilai respons dan konsentrasi sebelum melakukan analisis regresi [8,9,10]. Setelah menerapkan transformasi logaritmik pada data eksperimen, koefisien korelasi dari kurva regresi linier melebihi 0.999, yang secara signifikan lebih baik daripada hasil yang diperoleh tanpa transformasi logaritmik (seperti yang ditunjukkan pada Gambar 4).
Akurasi dan Keterulangan
Larutan stok hidroklorida spektinomisin diencerkan menjadi konsentrasi 0.25, 0.35, dan 0.50mg/mL. Untuk setiap konsentrasi, tiga sampel paralel disiapkan, dianalisis di bawah kondisi kromatografi yang ditentukan, dan kromatogram direkam. Kandungan dihitung menggunakan kurva regresi, dan pemulihan dan keterulangan dievaluasi. Hasilnya disajikan dalam Tabel 6.
Tabel 6 Hasil Uji Pemulihan
| No. |
Nilai Sebenarnya (mg/Ml) |
Nilai yang Dihitung (mg/Ml) |
Pemulihan (%) |
Pemulihan RSD (%) |
| 1 |
0.25 |
0.252 |
100.8 |
1.36
|
| 2 |
0.25 |
0.251 |
100.4 |
| 3 |
0.25 |
0.246 |
98.4 |
| 4 |
0.35 |
0.348 |
99.4 |
| 5 |
0.35 |
0.352 |
100.6 |
| 6 |
0.35 |
0.344 |
98.3 |
| 7 |
0.50 |
0.505 |
101.0 |
| 8 |
0.50 |
0.513 |
102.6 |
| 9 |
0.50 |
0.504 |
100.8 |
Batas Kuantifikasi (LOQ)
Encerkan larutan stok hidroklorida streptomisin hingga konsentrasi 12μg/mL. Analisis sampel di bawah kondisi kromatografi dan rekam kromatogram. Hitung rasio sinyal-ke-noise (S/N) dari puncak kromatografi hidroklorida streptomisin dan tentukan keterulangannya. Hasilnya ditunjukkan pada Tabel 7.
Tabel 7 Hasil Uji LOQ
| No. |
SNR |
Area Puncak (SU*s) |
RSD Area Puncak (%) |
| 1 |
15.647 |
3.416 |
8.45
|
| 2 |
10.634 |
2.928 |
| 3 |
15.728 |
3.145 |
| 4 |
12.842 |
3.529 |
| 5 |
14.662 |
3.396 |
| 6 |
11.076 |
3.730 |
Hasil menunjukkan bahwa di bawah persyaratan pedoman ICH S/N > 10, simpangan baku relatif dari area puncak untuk konsentrasi larutan hidroklorida spektinomisin ini memenuhi kriteria. Oleh karena itu, dapat berfungsi sebagai standar batas kuantitatif untuk hidroklorida spektinomisin.
5. Kesimpulan
Berdasarkan metode farmakope, studi ini menetapkan prosedur analitik yang andal dan kuat untuk kuantifikasi hidroklorida spektinomisin. Kondisi detektor hamburan cahaya evaporatif (ELSD) dioptimalkan secara sistematis. Metode yang dioptimalkan menunjukkan peningkatan stabilitas dan akurasi, sensitivitas deteksi yang lebih tinggi, dan rentang linier yang memuaskan.
Detektor ELSD3260 adalah detektor aliran terpisah suhu rendah yang baru dirancang dan dikembangkan. Sangat cocok untuk analisis zat non-volatil dan semi-volatil, memberikan alternatif yang berharga untuk senyawa yang tidak memiliki penyerapan UV. Dalam studi ini, penggunaan ELSD3260 untuk analisis hidroklorida spektinomisin menghasilkan nilai respons dan reproduktibilitas yang sangat baik, bersama dengan peningkatan sensitivitas deteksi. Temuan ini menunjukkan bahwa instrumen ini sangat cocok untuk analisis kuantitatif hidroklorida spektinomisin.
Pesan Anda harus antara 20-3.000 karakter!
