Penentuan Residu Eritromisin dalam Residu Fermentasi Antibiotik Menggunakan Sistem Kromatografi Cair-Spektrometri Massa Wayeal LCMS-TQ9200

Eritromisin adalah antibiotik makrolida yang dihasilkan melalui fermentasi Streptomyces erythreus. Ia memberikan efek antibakteri terutama dengan menghambat sintesis protein bakteri. Produksi eritromisin terutama bergantung pada teknologi bio-fermentasi, yang melibatkan langkah-langkah seperti pemilihan strain, kultur benih, fermentasi skala besar dalam tangki, ekstraksi, dan pemurnian. Setelah fermentasi, eritromisin diekstraksi dengan pelarut organik (seperti butil asetat), diikuti dengan pemurnian melalui kristalisasi atau pemisahan resin penukar ion, yang pada akhirnya menghasilkan garam kelas klinis (misalnya, eritromisin etilsuksinat). Namun, proses produksi eritromisin menghasilkan sejumlah besar ampas miselial (sisa fermentasi), yang mungkin mengandung sisa antibiotik, protein mikroba, dan produk sampingan metabolisme. Jika tidak dikelola dengan baik, residu ini dapat masuk ke rantai ekologi melalui pembuangan lingkungan atau penggunaan sebagai aditif pakan, yang menyebabkan berbagai bahaya: Eritromisin residu dapat mendorong penyebaran gen resistensi antibiotik dalam tanah dan badan air, mengganggu keseimbangan komunitas mikroba; diperkuat melalui rantai makanan, dapat memicu munculnya strain bakteri resisten pada hewan atau manusia, merusak efektivitas antibiotik; selanjutnya, bahan organik yang kurang dimanfaatkan dalam residu dapat menyebabkan pencemaran lingkungan. Oleh karena itu, regulasi ketat terhadap residu miselial adalah langkah penting untuk mengendalikan pencemaran dari produksi eritromisin.

Percobaan ini dilakukan dengan mengacu pada standar "T/PIAC 00003—2021 Standar Grup Asosiasi Industri Farmasi China - Metode untuk penentuan eritromisin dalam residu antibiotik, bahan dasar pupuk organik, tanaman, dan media lingkungan," menggunakan sistem spektrometri massa kromatografi cair Wayeal LCMS-TQ9200 untuk menentukan kandungan eritromisin dalam ampas miselial. Hasil percobaan menunjukkan bahwa uji kesesuaian sistem menunjukkan bentuk puncak yang baik dan linearitas yang baik, memenuhi persyaratan percobaan.

1. Instrumen dan Reagen

1.1 Daftar Konfigurasi LCMS

Tabel 1 Daftar Konfigurasi Instrumen

1.2 Reagen dan Standar

Tabel 2 Daftar Reagen dan Standar

1.3 Bahan Percobaan dan Peralatan Tambahan

Pembersih ultrasonik

Pengaduk vortex

Sentrifus kecepatan tinggi

2. Metode Percobaan

2.1 Pra-perlakuan Sampel

Timbang 0,5g sampel (akurat hingga 0,001 g) ke dalam tabung reaksi bersumbat kaca. Tambahkan 50mL asetonitril, vortex selama 1 menit untuk menghomogenkan campuran, dan lakukan ekstraksi berbantuan ultrasonik selama 20 menit. Kemudian pindahkan campuran ke tabung sentrifus 50mL dan sentrifus pada 4000rpm selama 10 menit. Kumpulkan sejumlah supernatant yang sesuai dan lewati melalui membran filter 0,22μm. Buang setidaknya 1mL filtrat awal, kemudian pindahkan sisa filtrat ke dalam vial LC amber untuk analisis.

2.2 Kondisi Percobaan

2.2.1 Kondisi Metode Kromatografi Cair

Kolom kromatografi: C18 1.7μm 2.1x50mm

Fase gerak: A: Asetonitril, B: 0.1% Asam format dalam air

Laju alir: 0.3mL/menit

Suhu kolom: 30℃

Volume injeksi: 2μL

2.2.2 Kondisi Metode Spektrometer Massa

Tabel 3 Parameter Sumber Ion Spektrometri Massa

3. Hasil Percobaan

3.1 Uji Kesesuaian Sistem

Hasil uji kesesuaian sistem menunjukkan puncak target yang terdefinisi dengan baik tanpa gangguan dari puncak asing, memenuhi semua persyaratan percobaan.

Gbr 1 Kromatogram Larutan Kerja Standar Eritromisin A (0.5ng/mL)

3.2 Rentang Linear

Kurva kalibrasi untuk eritromisin A disiapkan dengan mengencerkan secara seri larutan standar menggunakan larutan kerja konsentrasi menengah. Kurva menunjukkan linearitas yang sangat baik di seluruh rentang 0.5-500ng/mL, dengan koefisien korelasi (R²) lebih besar dari 0.99.

Tabel 4 Rentang Linear Eritromisin A

Gbr 2 Kurva Kalibrasi untuk Eritromisin A

3.3 Batas Deteksi (LOD) dan Batas Kuantifikasi (LOQ)

Dalam metode ini, batas deteksi (LOD) dan batas kuantifikasi (LOQ) untuk larutan standar eritromisin A ditentukan masing-masing menjadi 0.2ng/mL dan 0.5ng/mL. Rasio sinyal-terhadap-derau (S/N) yang sesuai adalah 110.02 dan 292.20, yang secara substansial melebihi persyaratan minimum 3 dan 10, sehingga memenuhi kriteria sensitivitas percobaan.

Gambar 3. Kromatogram Ion yang Diekstraksi untuk LOD dan LOQ Eritromisin A

3.4 Uji Presisi

Larutan eritromisin A disuntikkan berturut-turut tujuh kali, dengan hasil yang ditunjukkan pada gambar di bawah ini. Deviasi waktu retensi untuk eritromisin A adalah 0.19%, dan deviasi luas puncak adalah 0.96%, keduanya di bawah 5%, memenuhi persyaratan percobaan.

Gambar 4. Kromatogram Presisi Sampel Eritromisin A (7 Injeksi)

3.5 Uji Sampel

Mengikuti metode pra-perlakuan yang disebutkan di atas, luas puncak target dalam sampel padat adalah 7.4E6. Dihitung melalui metode standar eksternal, kandungan eritromisin A dalam larutan sampel ditentukan menjadi 400 ng/mL.

Gbr 5 Kromatogram Uji Sampel Eritromisin A

4. Kesimpulan

Metode ini menggunakan sistem spektrometri massa kromatografi cair Wayeal LCMS-TQ9200 untuk penentuan kandungan eritromisin A dalam residu fermentasi antibiotik. Data menunjukkan bahwa metode ini menunjukkan kinerja yang sangat baik: semua puncak kromatografi menunjukkan bentuk yang optimal tanpa ekor, dan sensitivitas memenuhi persyaratan percobaan. Koefisien korelasi linear (R²) melebihi 0.99. Deviasi waktu retensi dan luas puncak untuk semua senyawa di seluruh tujuh injeksi berturut-turut berada dalam 1%, yang menunjukkan presisi tinggi. Kromatogram sampel tidak menunjukkan gangguan dari puncak asing, dan kandungan sampel yang diukur adalah 400ng/mL. Metode ini dilengkapi dengan sistem Wayeal LC-MS/MS, memenuhi persyaratan untuk analisis kualitatif dan kuantitatif rutin dari sampel uji.