Penentuan Residu Antibiotik Amphenicol dalam Daging Ayam dengan Wayeal LCMS-TQ9200

Kata Kunci: LCMS, amfenikol, keamanan pangan, residu obat hewan.

1. Instrumen dan Pereaksi

1.1 Daftar Konfigurasi LCMS

Tabel 1 Daftar Konfigurasi Instrumen

1.3 Bahan Percobaan dan Peralatan Tambahan

Pembersih ultrasonik

Pengaduk Vortex

Evaporator nitrogen penangas air

Sentrifugasi kecepatan tinggi

2. Metode Percobaan

2.1 Persiapan Larutan

2.1.1 Larutan etil asetat beramonia 2%: Ambil 4mL air amonia dan encerkan menjadi 200mL dengan etil asetat.

2.1.2 Larutan natrium klorida 4%: Ambil 4g natrium klorida, larutkan dalam air, dan encerkan menjadi 100mL.

2.1.3 Larutan n-Heksana jenuh natrium klorida 4%: Ambil sejumlah larutan natrium klorida 4% yang sesuai, tambahkan kelebihan n-heksana, campur, biarkan hingga terjadi pemisahan lapisan, dan ambil lapisan n-heksana bagian atas.

2.1.4 Larutan kerja standar internal campuran: Ambil sejumlah larutan stok standar internal campuran yang sesuai, encerkan dengan metanol 20% untuk mencapai kloramfenikol-D5 pada 10ng/mL dan standar internal lainnya (florfenikol-D3, tiamfenikol-D3, dan florfenikol amin-D3) pada 50ng/mL masing-masing.

2.2 Pra-perlakuan Sampel

2.2.1 Ekstraksi Sampel: Timbang 2g sampel (akurat hingga ±0.01g), tambahkan 100µL larutan kerja standar internal campuran, vortex selama 1 menit, tambahkan 10mL larutan etil asetat beramonia 2%, vortex selama 10 menit, sentrifugasi pada 8000rpm selama 5 menit, dan kumpulkan supernatan. Tambahkan lagi 10mL larutan etil asetat beramonia 2% ke residu, dan ulangi prosedur ekstraksi. Gabungkan kedua supernatan, uapkan hingga kering di bawah aliran nitrogen pada 50°C, dan simpan untuk digunakan.

2.2.2 Pemurnian Sampel: Tambahkan 3mL larutan natrium klorida 4% ke residu pemurnian, vortex hingga larut, kemudian tambahkan 5mL larutan n-heksana jenuh natrium klorida 4%, vortex selama 30 detik, sentrifugasi pada 8000 rpm selama 5 menit, dan buang lapisan n-heksana bagian atas. Ulangi prosedur penghilangan lemak sekali. Tambahkan 5mL larutan etil asetat beramonia 2%, vortex selama 10 menit, sentrifugasi pada 8000 rpm selama 5 menit, dan kumpulkan supernatan. Tambahkan lagi 5mL larutan etil asetat beramonia 2% ke residu dan ulangi prosedur ekstraksi. Gabungkan supernatan, uapkan hingga kering di bawah aliran nitrogen pada 50°C, tambahkan 1mL larutan metanol 20%, vortex selama 30 detik, saring melalui membran, dan tunggu analisis instrumental.

2.3 Kondisi Percobaan

2.3.1 Kondisi Kromatografi Cair

Kolom kromatografi: C18 1.7μm 2.1x50mm

Fase gerak: A: Asetonitril; B: 2 mM Amonium Format dalam Air

Laju alir: 0.3mL/menit

Suhu kolom: 40 ℃

Volume injeksi: 5µL

2.3.2 Kondisi Spektrometri Massa

Tabel 3 Parameter Sumber Ion

3. Hasil Percobaan

3.1 Kromatogram Standar

Penentuan empat antibiotik amida dan standar internalnya selesai dalam waktu 6 menit. Semua puncak menunjukkan bentuk puncak yang baik tanpa ekor, dan setiap senyawa menunjukkan respons yang memuaskan, memenuhi persyaratan percobaan.

Gbr 1 Kromatogram 4 Antibiotik Amfenikol dan Standar Internal (Kloramfenikol 0.2ng/mL, Antibiotik Lainnya 1ng/mL)

3.2 Rentang Linear

Ambil sejumlah larutan standar campuran alkohol amida yang sesuai dan encerkan secara bertahap ke serangkaian konsentrasi untuk menyiapkan kurva standar. Metode standar internal isotop digunakan untuk analisis kuantitatif. Rentang linear adalah 0.2-10 ng/mL untuk kloramfenikol dan 1-50 ng/mL untuk florfenikol amin, tiamfenikol, dan florfenikol. Penyimpangan antara hasil deteksi linear dan konsentrasi yang diketahui kurang dari penyimpangan maksimum yang diizinkan, dengan nilai R² berkisar antara 0.9958 hingga 0.9998, menunjukkan linearitas yang sangat baik untuk semua komponen.

Tabel 4 Rentang Linear Senyawa

Gbr 2 Data Kurva Kalibrasi dari Empat Senyawa

3.3 LOD dan LOQ

Standar Keamanan Pangan Nasional China GB 31658.20-2022 menetapkan bahwa untuk metode ini, batas deteksi (LOD) untuk kloramfenikol adalah 0.1µg/kg dan batas kuantifikasi (LOQ) adalah 0.2µg/kg; sedangkan untuk tiamfenikol, florfenikol, dan florfenikol amin, LOD adalah 0.5µg/kg dan LOQ adalah 1 µg/kg. Rasio sinyal-ke-noise untuk semua senyawa target pada konsentrasi batas deteksi (LOD) dan batas kuantifikasi (LOQ) yang ditentukan secara signifikan lebih besar dari 3 dan 10, yang sesuai dengan persyaratan sensitivitas yang ditentukan dalam standar nasional.

Tabel 5 Batas Deteksi dan Kuantifikasi untuk Setiap Senyawa

Gbr 3 Kromatogram Batas Deteksi dan Batas Kuantifikasi untuk Empat Senyawa

3.4 Pengujian Presisi

Ambil konsentrasi rendah, sedang, dan tinggi dari larutan campuran standar amfenikol, dan lakukan enam injeksi berturut-turut untuk membandingkan penyimpangan waktu retensi dan luas puncak. Hasilnya ditunjukkan pada tabel di bawah ini. Penyimpangan waktu retensi dari semua senyawa amfenikol kurang dari 1%, dan penyimpangan luas puncak kurang dari 5%, memenuhi persyaratan presisi RSD ≤ 15% yang ditentukan oleh standar nasional.

Tabel 6 Uji Presisi untuk Setiap Senyawa

Gbr 4 Kromatogram Presisi dari Empat Senyawa Alkohol Amida

3.5 Uji Pemulihan Spiking Matriks

Akurasi metode deteksi ini dievaluasi menggunakan uji pemulihan spiking. Tambahkan konsentrasi sampel standar yang diketahui ke sampel matriks kosong pada rasio yang berbeda untuk pra-perlakuan, menyiapkan sampel yang di-spiking matriks pada konsentrasi tinggi, sedang, dan rendah. Setiap tingkat konsentrasi sampel yang di-spiking dianalisis secara independen enam kali. Tingkat pemulihan dihitung dengan membandingkan konsentrasi yang terdeteksi dalam matriks sebelum dan sesudah spiking, sehingga mengevaluasi akurasi metode. Hasilnya ditunjukkan sebagai berikut: dalam matriks ayam, tingkat pemulihan spiking dari semua senyawa berkisar antara 94.5% hingga 107.2%, dengan CV dalam 5%, yang menunjukkan bahwa akurasi memenuhi persyaratan metode.

Tabel 6 Tingkat Pemulihan Senyawa dalam Matriks Ayam yang Di-spiking

3.6 Uji Sampel

Sampel dada ayam yang dibeli secara acak dari supermarket diekstraksi dan dimurnikan menggunakan metode pra-perlakuan sampel yang disebutkan di atas. Setelah menguji sampel pada instrumen, tidak ada satu pun dari empat antibiotik amida yang terdeteksi.

Gbr 5 Kromatogram Empat Senyawa Alkohol Amida dalam Sampel Dada Ayam Supermarket

4. Kesimpulan

Metode ini menggunakan sistem spektrometri massa kromatografi cair Wayeal LCMS-TQ9200 untuk penentuan antibiotik amfenikol dalam makanan yang berasal dari hewan, yang memungkinkan perolehan senyawa secara bersamaan dalam mode ion positif dan negatif. Data menunjukkan bahwa metode ini memberikan puncak kromatografi yang berbentuk baik tanpa ekor, dan sensitivitasnya memenuhi persyaratan standar nasional. Koefisien korelasi linear semuanya lebih besar dari 0.99. Penyimpangan waktu retensi untuk semua senyawa di enam injeksi berturut-turut adalah dalam 1%, dan penyimpangan luas puncak adalah dalam 5%, menunjukkan presisi yang baik. Tingkat pemulihan spiking dalam matriks ayam berkisar antara 94.5% hingga 107.2%, dengan CV dalam 5%, yang menunjukkan bahwa akurasi memenuhi persyaratan metodologi. Sampel dada ayam yang dibeli secara acak dari supermarket dianalisis, dan tidak ada satu pun dari empat antibiotik amfenikol yang terdeteksi. Hal ini menunjukkan bahwa metode tersebut, yang dilengkapi dengan sistem spektrometri massa kromatografi cair Wayeal, memenuhi persyaratan untuk deteksi kualitatif dan kuantitatif rutin dari sampel target.