Penentuan Aflatoksin B₁, Karsinogen Golongan 1, pada Tanaman Berminyak dengan Sistem Wayeal LCMS-TQ9200 LC-MS/MS

Aflatoksin B₁adalah metabolit sekunder yang sangat beracun yang diproduksi terutama oleh Aspergillus flavusdan Aspergillus parasiticus. Di antara keluarga aflatoksin, ia menunjukkan toksisitas terkuat dan distribusi terluas. Ia memberikan efek toksiknya dengan menghambat sintesis DNA dan RNA intraseluler dan mengganggu metabolisme protein, dengan efek merusak yang sangat ditargetkan pada hati.Dibandingkan dengan mikotoksin lain seperti okratoksin dan patulin, aflatoksin B₁sangat beracun dan memiliki sifat karsinogenisitas yang kuat. Ini telah diklasifikasikan sebagai a Karsinogen golongan 1oleh Organisasi Kesehatan Dunia (WHO). Hal ini sering terdeteksi pada tanaman penghasil minyak seperti kacang tanah, jagung, kacang-kacangan, dan minyak nabati, menjadikannya kontaminan prioritas untuk pengendalian keamanan pangan di seluruh dunia.

Kontaminasi dengan aflatoksin B₁biasanya terjadi ketika tanaman penghasil minyak terkena suhu tinggi dan kondisi kelembaban tinggi selama penanaman, pemanenan, atau penyimpanan, yang mendorong pertumbuhan jamur. Selain itu, karena sifat kimianya yang stabil, aflatoksin B₁tidak dapat dihancurkan oleh suhu memasak konvensional, sehingga menyebabkan masalah residu berulang pada produk pertanian dan makanan olahan.

Menelan dosis tinggi dalam jangka pendek dapat menyebabkan keracunan akut, yang ditandai dengan gejala seperti sakit perut yang parah, muntah, penyakit kuning, dan gagal hati, yang dapat berakibat fatal pada kasus yang parah. Paparan dosis rendah dalam jangka panjang menyebabkan penumpukan di hati, menyebabkan kerusakan hati kronis seperti fibrosis hati dan sirosis, dan bahkan dapat memicu kanker hati primer. Populasi dengan imunitas rendah, termasuk anak-anak, orang lanjut usia, dan individu dengan penyakit hati yang sudah ada sebelumnya, mempunyai risiko lebih tinggi terkena aflatoksin B.₁peracunan.

Di Tiongkok, standar nasional GB 2761-2017 (Standar Keamanan Pangan Nasional – Tingkat Maksimum Mikotoksin dalam Makanan) menetapkan batas residu maksimum aflatoksin B.₁dalam berbagai jenis makanan. Selain itu, GB 5009.22-2016 (Standar Keamanan Pangan Nasional – Penentuan Aflatoksin B dan G dalam Makanan)memberikan metode analisis resmi untuk penentuan aflatoksin B₁.

Catatan aplikasi ini menjelaskan pembuatan metode kromatografi cair pengenceran isotop-spektrometri massa tandem (LC-MS/MS) untuk penentuan aflatoksin B.₁menggunakan sistem Wayeal LCMS-TQ9200 LC-MS/MS.

Kata kunci:Kuadrupol rangkap tiga; Aflatoksin B₁; Kromatografi cair pengenceran isotop-spektrometri massa tandem.

1. Instrumen dan Reagen

1.1 Konfigurasi Instrumen

Tabel 1 Daftar Konfigurasi Instrumen

1.2 Reagen dan Standar

Tabel 2 Reagen dan Standar

1.3 Bahan Percobaan dan Peralatan Penolong

Pencampur pusaran

Mesin sentrifugal berkecepatan tinggi

Neraca analitis

Mesin sentrifugal

Manifold ekstraksi fase padat (SPE) (dengan pompa vakum)

Penguap nitrogen

Pengocok

2. Metode Eksperimen

2.1 Persiapan Solusi

2.1.1 Larutan Amonium Asetat 5 mmol/L:Timbang 0,39g amonium asetat, larutkan dalam air, dan encerkan hingga 1000mL. Aduk rata.

2.1.1 Larutan Metanol-Asetonitril:Tambahkan 100mL asetonitril ke dalam 100mL metanol, lalu aduk rata.

2.2 Perlakuan Awal Sampel

2.2.1 Ekstraksi Sampel

Masukkan tepung terigu melalui saringan uji bukaan 2 mm. Timbang 5g sampel (akurat hingga 0,01g) ke dalam tabung sentrifugasi 50mL. Tambahkan 100μL larutan kerja standar internal isotop (100ng/mL), campur dengan vorteks, dan diamkan selama 30 menit. Tambahkan 20mL larutan metanol-air (70+30, v/v), vorteks hingga tercampur, dan kocok dalam orbital shaker selama 20 menit. Centrifuge dengan kecepatan 6000r/menit selama 10 menit. Kumpulkan supernatan untuk digunakan selanjutnya.

2.2.2 Pemurnian Sampel

Pindahkan 4 mL supernatan secara akurat ke dalam wadah, tambahkan 23 mL Triton X-100 1% dalam PBS, dan aduk rata.

Setelah cairan asli dalam kolom imunoafinitas terkuras seluruhnya, pindahkan larutan sampel di atas ke dalam tabung suntik 50 mL. Sesuaikan laju aliran sehingga larutan sampel melewati kolom secara stabil dengan laju 1–3 mL/menit. Setelah larutan sampel terkuras seluruhnya, tambahkan 2 × 10 mL air ke dalam tabung semprit dan cuci kolom imunoafinitas dengan laju aliran tetap. Setelah air terkuras, keringkan kolom menggunakan pompa vakum.

Putuskan sambungan sistem vakum. Tempatkan tabung reaksi bertingkat 10 mL di bawah kolom imunoafinitas, keluarkan tabung suntik 50 mL, dan tambahkan 2 × 1 mL metanol untuk mengelusi kolom dengan laju aliran terkontrol 1–3 mL/menit. Kemudian keringkan kembali kolom tersebut dengan menggunakan pompa vakum. Kumpulkan semua eluat ke dalam tabung reaksi.Uapkan eluat secara perlahan hingga hampir kering di bawah aliran nitrogen pada suhu 50 °C. Tambahkan 1 mL fase gerak awal, vorteks selama 30 detik untuk melarutkan residu. Saring melalui filter membran 0,22 μm, dan kumpulkan filtrat ke dalam botol autosampler untuk injeksi selanjutnya.

2.3 Kondisi Percobaan

2.3.1 Metode Kromatografi Cair

Kolom: C18, 1.7μm, 2.1×50mm

Fase Gerak Fase: A: Larutan metanol-asetonitril; Fase B: larutan amonium asetat 5mmol/L

Laju Aliran: 0,3 mL/menit

Suhu Kolom: 40°C

Volume Injeksi: 3µL

2.3.2 Metode Spektrometri Massa

Tabel 3 Parameter Spektrometri Massa Majemuk

Catatan: Tanda bintang (*) menunjukkan ion kuantitatif.

3. Hasil Percobaan

3.1 Kromatogram Standar

Penentuan aflatoksin B₁dan standar internal isotop 13C17-aflatoksin B₁selesai dalam waktu 5 menit. Seperti diilustrasikan pada Gambar 1, kedua analit menunjukkan bentuk puncak yang sangat baik dan respons yang memuaskan, sehingga memenuhi persyaratan untuk analisis eksperimental.

Gambar 1 Kromatogram Aflatoksin B₁dan Standar Internal Isotop 13Bab 17​-Aflatoksin B₁

3.2 Rentang Linier

Volume yang sesuai dari larutan stok standar dan larutan kerja standar internal isotop campuran dipindahkan secara akurat dan diencerkan dengan fase gerak awal untuk menyiapkan serangkaian larutan kerja standar dengan aflatoksin B.₁konsentrasi 50, 20, 10, 5, 2, 1, dan 0,5ng/mL. Setiap larutan mengandung standar internal isotop pada konsentrasi 2ng/mL. Kurva kalibrasi dibuat menggunakan standar ini. Pada rentang linier 0,5–50ng/mL, dan setelah koreksi menggunakan 13C 17-aflatoksin B₁sebagai standar internal, penyimpangan antara aflatoksin B yang diukur dan nominal₁konsentrasi berada dalam deviasi maksimum yang diijinkan. Koefisien korelasi (R) lebih besar dari 0,999, menunjukkan linearitas yang sangat baik.

Gambar 2 Kurva Standar Aflatoksin B₁

3.3 Pengulangan

Larutan standar pada tiga konsentrasi (1, 10, dan 20 ng/mL) disuntikkan enam kali berturut-turut. Hasilnya ditunjukkan pada tabel di bawah ini. Deviasi standar relatif (RSD) dari waktu retensi dan jumlah sampel untuk aflatoksin B₁pada konsentrasi rendah, sedang, dan tinggi semuanya berada dalam kisaran 5%, memenuhi persyaratan percobaan.

Tabel 4 Uji Pengulangan Aflatoksin B₁pada Konsentrasi Rendah, Sedang, dan Tinggi

3.4 Pemulihan Lonjakan

Aflatoksin B₁larutan standar dimasukkan ke dalam sampel untuk mencapai konsentrasi akhir 5ng/mL. Sampel berduri kemudian dianalisis dengan LC-MS/MS. Hasil rata-rata dari enam suntikan berturut-turut adalah 5,147ng/mL, dengan RSD 1,954%. Tingkat pemulihan yang dihitung adalah 102,94%, yang memenuhi persyaratan percobaan.

3.5 Residu Kosong

Setelah terus menerus menyuntikkan larutan standar 20 ng/mL, sampel kosong kemudian disuntikkan untuk mengevaluasi sisa. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 3, tidak ada sisa yang terdeteksi pada sampel kosong.

Gambar 3 Kromatogram Kosong Senyawa

3.6 Uji Sampel

Aflatoksin B₁tidak terdeteksi pada Sampel A (Gambar 4).

Gambar 4 Kromatogram Aflatoksin B₁dalam Sampel A

4. Kesimpulan

Pada penelitian ini, metode kromatografi cair pengenceran isotop-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) untuk penentuan aflatoksin B₁didirikan menggunakan sistem spektrometri massa tandem kromatografi cair Wayeal LCMS-TQ9200. Data yang diperoleh menunjukkan bahwa semua puncak kromatografi menunjukkan bentuk puncak yang baik tanpa tailing. Sensitivitas memenuhi persyaratan eksperimental, dan koefisien korelasi (R) lebih besar dari 0,999, memenuhi kriteria linearitas. Pengulangan pada konsentrasi rendah, sedang, dan tinggi berada dalam 5%, dan tidak ada sisa sistem yang diamati setelah injeksi sampel konsentrasi tinggi. Hasil ini menunjukkan bahwa metode tersebut, bila dilengkapi dengan sistem spektrometri massa kromatografi cair-tandem Wayeal, memenuhi persyaratan untuk analisis kualitatif dan kuantitatif rutin terhadap sampel target.