62/2000 Melindungi kesehatan bayi dan anak-anak!

Pengantar

Oligosakarida susu manusia (HMO) adalah sekelompok oligosakarida dengan tingkat polimerisasi tidak lebih dari 3, secara alami terdapat dalam susu manusia;Mereka adalah komponen padat terbesar ketiga dalam ASI, setelah laktosa dan lemak. Mereka mengatur flora usus, khususnya mempromosikan kolonisasi Bifidobacteriaceae di usus bayi, sementara juga menjaga kesehatan usus.Mendukung perkembangan sistem kekebalan tubuh dan otakSejak formula bayi pertama yang diperkaya dengan HMO diluncurkan di Amerika Serikat pada tahun 2015,berbagai macam susu formula bayi, susu dan produk susu, suplemen kesehatan pencernaan dan makanan fungsional yang mengandung HMO telah dijual di seluruh dunia.2'-fucosyllactose, 3'-fucosyllactose, difosyllactose, lacto-N-neotetraose, lacto-N-tetraose, 3'-sialyllactose dan 6'-sialyllactose.

Di antara metode deteksi HMO yang umum, kromatografi cair membutuhkan reaksi derivasi sebelum deteksi, melibatkan persiapan sampel yang kompleks, dan reagen derivasi sering beracun;sifat HMO yang tidak stabil terhadap panas juga menyebabkan respons rendah dan pengulangan yang buruk dalam LC-MSSebaliknya, kromatografi ion dengan deteksi amperometrik untuk karbohidrat menawarkan persiapan sampel yang sederhana, respon tinggi dan pengulangan yang baik, memberikan keuntungan yang jelas untuk analisis HMO.Catatan aplikasi ini menggunakan natrium hidroksida yang disiapkan secara manual, natrium asetat dan air ultra-murni sebagai eluen, dan menggunakan kromatograf ion WAYEAL IC6300 untuk menentukan HMOs dalam formula bayi.sensitivitas tinggi dan linearitas yang baik, memberikan referensi yang berguna untuk deteksi HMO dalam makanan.

Kata kunci: kromatograf ion; Oligosakarida susu manusia; Detektor amperometrik.

1Instrumen, Peralatan dan Reagen

1.1 Reagen dan Standar

Tabel 1. Daftar reagen dan standar

1.2 Materi laboratorium dan peralatan tambahan

• 1.2.1 Timbangan analitik (kemampuan membaca 0,1 mg);
• 1.2.2 Mandi air termostatik;
• 1.2.3 Centrifuge;
• 1.2.4 Filter membran polyethersulfone (PES) berair (0,45 μm);
• 1.2.5 Air ultra murni;
• 1.2.6 Perangkat penyaringan vakum;
• 1.2.7 Kartrid ekstraksi fase padat RP (SPE);
• 1.2.8 Jarum suntik sekali pakai (20 ml, 5 ml).

2. Metode Percobaan

2.1 Persiapan larutan

• 2.1.1 200 mmol/L larutan natrium hidroksida: Pipet 10,5 ml 50% NaOH, diencerkan dengan air hingga 1000 ml, dan disaring di bawah vakum.
• 2.1.2 Campuran larutan 75 mmol/L NaOH dan 250 mmol/L natrium asetat: Timbang dengan tepat 20,51 g natrium asetat, larut dalam air dan transfer ke 1000 mL kolob volumetrik; dengan tepat pipet 3.95 mL 50% NaOH, diencerkan hingga 1000 ml dengan air ultra murni, dan disaring di bawah vakum.
• 2.1.3 larutan 3% asam sulfosalicyl: Beratkan 3,0 g asam sulfosalicyl, larut dalam air dan encerkan sampai 100 ml (siapkan segar).
• 2.1.4 Campuran larutan baku standar: Timbang dengan tepat 5 mg masing-masing 2'-fukusillactose, 3'-fukusillactose, 3'-sialyllactose, 6'-sialyllactose, lacto-N-tetraose dan lacto-N-neotetraose (ke 0).1 mg), ditempatkan ke dalam kolong volumetrik 10 ml, larut dalam air dan diencerkan sampai dengan tanda untuk menyiapkan campuran 500 mg/L. Timbang secara terpisah 1 mg difukosilaktosa (dengan akurasi 0,1 mg),tempatkan ke dalam kolob 10 ml, larut dan diencerkan sampai tanda untuk mempersiapkan 100 mg/L.
• 2.1.5 Campuran larutan kerja standar: Pipetkan larutan campuran dengan tepat (2.1.4) ke dalam bola volumetrik dan diencerkan dengan air untuk menyiapkan larutan kerja campuran 2'-FL, 3'-FL, 3'-SL, 6'-SL, LNT, LNnT dan DFL pada suhu 0.5, 2, 4, 6, 8 dan 10 mg/L. Persiapkan segar sebelum digunakan.

2.2 Persiapan Sampel

Timbang sampel sekitar 2,0 g ke dalam gelas kecil, aduk dengan baik dengan 50 ml air hangat (sekitar 50 °C), tambahkan 40 ml larutan asam sulfosalicyl 3%Transfer dan encerkan ke 100 ml dalam kolong volumetrik, dan sonicate selama 10 menit. Filter melalui kertas filter atau centrifuge (12.000 r/menit, 15 menit).buang 3 ml pertama dan kumpulkan eluat untuk analisisSebelum digunakan, kondisikan kartrid RP SPE dengan 20 ml metanol diikuti dengan 15 ml air, dan keseimbangan selama 30 menit.

2.3 Kondisi percobaan

2.3.1 Kondisi kromatografi ion

3. Hasil

3.1 Jangkauan linier

Alikuota yang tepat dari setiap larutan kerja standar campuran dianalisis.penyimpangan antara konsentrasi yang diukur dan konsentrasi nominal berada dalam penyimpangan maksimum yang diizinkan, nilai R2 di atas 0.999, dan semua komponen menunjukkan linearitas yang baik.

Tabel 2. Jangkauan linier senyawa

Gambar 1. Kromatogram kalibrasi yang tumpang tindih dari tujuh standar HMO

3.2 Hasil pengujian sampel

Sampel 1 dan 2 diuji setelah pengenceran 10 kali. Konten dari masing-masing dari tujuh HMO dihitung sebagai berikut: X adalah kandungan dalam sampel (mg/100g);c adalah konsentrasi dalam larutan sampel dari kurva kalibrasi (mg/L)V adalah volume konstan (mL); m adalah massa sampel (g); f adalah faktor pengencer.

Gambar 2. kromatogram ion sampel 1 diencerkan 10 kali

Gambar 3. Kromatogram ion sampel 2 diencerkan 10 kali

Tabel 3. Hasil uji sampel

3.3 Keakuratan

Larutan kerja pada tingkat kalibrasi keempat dianalisis dalam enam injeksi berturut-turut di bawah kondisi di 2.3.1RSD dari tujuh kandungan HMO dihitung untuk mengevaluasi kebalikan. Hasil di bawah ini menunjukkan presisi metode yang baik.

3.3.1 Keakuratan Pengulangan Standar

Hasil tes:

Gambar 4. Kromatogram tumpang tindih dari injeksi replika independen dari standar kalibrasi S4

Tabel 4. Keakuratan pengulangan standar

3.4 Batas Deteksi dan Kuantitas

LOD: Aliquots dari larutan standar diencerkan menjadi larutan campuran yang mengandung 10 μg/L 3'-FL, 30 μg/L DFL, 30 μg/L 2'-FL, 22 μg/L LNnT, 67 μg/L LNT, 67 μg/L 6'-SL dan 160 μg/L 3'-SL;20 sampel paralel disiapkan dan dianalisis.

LOQ: Alikuot larutan standar diencerkan menjadi larutan campuran yang mengandung 30 μg/L 3'-FL, 80 μg/L DFL, 90 μg/L 2'-FL, 65 μg/L LNnT, 200 μg/L LNT, 200 μg/L 6'-SL dan 500 μg/L 3'-SL;enam sampel paralel disiapkan dan dianalisis.

Hasil tes adalah sebagai berikut:

Tabel 5. Hasil S/N untuk LOD dan LOQ dari tujuh HMO

3.5 Spesifisitas

Alikuota (100 μL masing-masing) larutan standar glukosa, fruktosa, sukrosa dan maltosa ditambahkan ke kolong volumetrik 10 ml dan diencerkan sampai tanda dengan larutan sampel 2 diencerkan 67 kali.Larutan dianalisis untuk memeriksa apakah gula ini mengganggu puncak dari tujuh HMOSeperti yang ditunjukkan di bawah ini, empat gula tidak menunjukkan gangguan yang signifikan dengan penentuan tujuh HMO dalam susu bubuk.

Gambar 5. Kromatogram yang dilapisi kalibrasi S6, Sampel 2, dan Sampel 2 ditambahkan dengan empat standar gula

4Kesimpulan

Validasi ini menggunakan kromatografi ion WAYEAL untuk memverifikasi metode untuk menentukan HMO dalam makanan.LNnT, LNT, 6'-SL dan 3'-SL semuanya terelut dalam waktu 60 menit; sensitivitas memenuhi persyaratan standar nasional; dan koefisien korelasi linier semuanya lebih besar dari 0.999. Pengulangan baik dari standar dan sampel. Kecuali untuk dua sialyllactose, LOD dan LOQ berada pada tingkat μg/L. Metode ini memiliki spesifisitas yang baik, tanpa impurities mengganggu ditemukan,dan secara keseluruhan memenuhi persyaratan standar.